1 绪论1.1纤维素酶简介纤维素作为植物光合作用的主要多糖类产物,是地球上最为丰富的可再生性天然资源。
据估计,地球纤维素每年通过光合作用的更新量约为4. 0×1010吨,Liitzen 等在1983 年推算出纤维素的合成速率相当于全人类每人每天70 千克,这一惊人的结果足以显示其对整个人类的价值所在。
然而,目前约80 %未被开发利用,具有极为诱人的前景。
对纤维素的深入研究和利用必将是解决当前世界许多国家普遍面临的粮食,饲料和能源短缺及环境污染等问题的一条有效途径,并已成为21 世纪各国共同关注的一项重大课题。
植物纤维素的高聚合度、毛细管结构、木质素和半纤维素所形成的保护层及其超分子结构中具有高结晶度(crystallinity index) 的结晶区存有大量氢键(包括分子链内、链间及分子链与表面分子之间形成的氢键) 是造成纤维素难以被利用的根本原因。
从高效和环保的角度出发,纤维素被彻底分解而无污染的一条有效途径便是利用纤维素酶(cellulase) 的水解作用。
可是,当前纤维素酶的高昂费用是其难以在工业上被推广应用的主要因素。
过去的一些研表明,对含纤维素物质进行一定的前处理(方法主要有球磨法,汽爆法,γ射线照射法,酸碱法和氧化法等) ,但仅是在较低的程度上提高了纤维素酶的水解效率。
一些高产菌株的获得,在目前条件下也难以大幅度降低纤维素酶的成本。
还需要在这方面开展更广泛而深入地研究。
纤维素酶(cellulase)是利用产纤维素酶的菌株经过固体发酵或液体深层发酵提取精制而成的液体状酶制剂。
纤维素酶由三种功能不同但又互补的酶组成,能水解天然纤维素成为葡萄糖分子。
这三种酶是内切葡聚糖(Endoglucanase.EG.EC3.2.1.4)、外切纤维素酶(cellobiohydrolase. CBH, EC 3. 2. 1. 91)和β-葡萄糖苷酶(β-Glucanases. GE, EC3.2.1.21)。
木酶属被认为是纤维素酶系最全面,分解天然纤维素活力最高的一类丝状真菌。
纤维素酶对能源危机、食品和饲料紧张及环境污染等问题的解决有积极的作用,纤维素酶的开发利用将会产生很大的经济价值。
纤维素(cellulose )是植物细胞壁的主要成分，约占植物干重的三分之一至二分之一。
世界生产和目前储存的纤维素生物量比任何一种碳水化合物都要多得多，是一种十分巨大的生物质资源，可为人类提供用之不尽的能源。
但是目前这一资源的利用大约不到地球上总贮存量的0.5，仅有一小部分被用于纺织、造纸、建筑、饲料、制药、农肥、燃料等方面，大部分未得到利用而被抛弃或焚烧，不仅造成资源的巨大浪费，而且污染环境，危害很大。
如果能利用纤维素酶将大量的纤维素资源酶解成单糖，再经发酵可生产出化工原料、饲料、燃料、食物和药物等，开辟饲料、发酵工业原料和人类食品的新来源，同时还可以处理废物、减少公害、保护环境。
因此研究纤维素资源的综合利用具有深远的意义，日益引起世界各国的关注和重视。
1.2纤维素酶的研究状况早期就有研究表明,纤维素酶是一类胞外酶,从培养物滤液中就可以很容易得到。
它又属于诱导酶(但在细菌方面以固有酶居多) ,在诱导物存在下,才能大量产生。
纤维素酶的分泌又受分解代谢产物阻遏(catabolite repression) 和反馈抑制(feedback inhibition) 两种作用。
许多不溶性的纤维素、可溶性的纤维衍生物、一些低聚糖类对某些单糖和二糖均可作为纤维素酶的诱导物。
但需要一提的是,纤维二糖、葡萄糖和甘油等低分子可溶性糖在低浓度时有促进作用而较高浓度时便开始抑制。
当然,对于不同微生物来说,同一浓度的同一物质也可能有着不同甚至完全相反的作用。
这方面的研究还甚少。
纤维素酶的分泌与细胞膜的通透性有着密切的关系,这是Reese 和Maguire 得出的结论,他们在绿色木霉QMa6 的培养基中添加一定浓度的油酸钠、亚油酸钠、吐温80 和蔗糖单棕榈酯等表面活性剂,结果都大量增加了纤维素酶产量,且缩短了产酶时间。
在纤维素酶的生产过程中,pH 值和发酵时间是关键。
Mandles等发现,在分批培养物发酵过程中,起初pH 最好是自然下降到3. 0～3. 5 ,再加控制以防止pH 降低,消耗纤维素以后自然上升,这样有利于酶的大量分泌。
连续培养的情况不同,保持较低pH 时,菌生长受到抑制,酶产量减少,而保持pH5. 0 时则可提高酶产量。
纤维素酶的发酵过程中,有分泌高峰期,且高峰期的稳定性因培养基不同而有很大差异。
故准确控制发酵时间是纤维素酶生产的另一个重要参数。
综合上述,这里引发了一个新思路,就是对发酵不同阶段分别进行不同控制(如pH 值、温度、通气量、培养基成分) 可能在很大程度上提高酶产量。
要获得较高酶产量,发酵方法是非常重要的方面,目前生产纤维素酶的国家主要有日本、美国、德国和荷兰。
日本过去多用固体曲生产,后来由于这种方法难于监控,某些组分常常吸附于固体残余物上,增加了提取难度,不利于现代化流水作业,于是不少改为液体深层发酵。
美国一直都是使用这种方法,并在此基础上出现了流加培养法、分批发酵法、连续发酵法、二次发酵法以及细胞循环法等等。
混合微生物发酵法是纤维素酶生产中的又一新途径。
因不同真菌的纤维素酶系在各组分均衡性方面有互补的现象。
木霉纤维素酶系中含有较多的CBH 和EG,缺少βG,而另一类真菌如黑曲霉、海枣曲霉( A .phoenicus ) 和可可球二孢( Bot ryodi plodic theobromoe ) 形成的纤维素酶系却以βG为主。
故以微生物生态学为基础,将以上两类菌混合在一起发酵,寻求二者均能大量分泌纤维素酶的发酵方法和条件,生产出优质高效的混合纤维素酶,目前只有极少关于这方面的浅层研究。
1.2.1国外研究概况1906年Seilliere发现蜗牛的消化液能够水解棉花纤维素并产生葡萄糖，这是人类首次发现纤维素酶。
随后他的工作于1913年得到Alexandrowicz的证实。
1933年Grassman等研究了一种真菌的纤维素酶系，分辨出两个组分，这是首次从真菌中分离出纤维素酶。
四、五十年代，以美国陆军Natick研究发展中心为代表的世界许多研究机构开始从不同方面对此进行了艰苦而卓有成效的探索，对产生纤维素酶的微生物进行了大量分离筛选工作，建立起较为完整的分离筛选方法。
1950年Reese等提出纤维素酶作用方式的G-Cx假说以后，开始转入纤维素酶的基础研究，包括纤维素酶的性质、作用方式、培养条件和活力测定方法等等。
六十年代以后，由于分离技术的发展，推动了纤维素酶的分离纯化工作，对纤维素酶的组分、作用方式以及诱导作用等方面的研究进展比较快:并且实现了纤维素酶制剂的工业生产;在应用上也取得了一定成绩。
早在1967脾国外专利中就提出了用纤维素酶来消除棉织物上出现的微纤维(绒毛小球)的想法.但这个想法一直未能实现。
直到1985年，采用腐殖根霉(Humicola insolens)发酵的方法，制得了世界上第一个洗涤剂用的纤维素酶，其产品命名为Cellulaseo 1987年又推出了一种细菌纤维素酶(Bacterial CeIlulase)，并成功地用于Attack洗衣粉。
从此，纤维素酶也就正式加入了洗涤剂酶的行列。
从上世纪八十年代开始，随着分子生物学和基因工程的发展，人们开始利用基因工程的方法对纤维素酶基因进行克隆和一级结构的测定，利用遗传工程从分子生物学水平对纤维素酶生产菌株进行诱变育种，并对纤维素酶蛋白质的氨基酸序列及其分离纯化等方面进行了深入细致的研究。
到目前为止，在SWISS-PROT 蛋白质数据库中，已有140个内切酶，19个外切酶和102个Q_葡萄搪普酶的全序列;1988年开始利用结构生物学及蛋白质工程的方法对纤维素酶分子的结构和功能进行研究，包括纤维素酶结构域的拆分与解析、功能性氨基酸的确定、水解的双置换机制的确立、以及分子折叠和催化机制关系的探讨。
然而由于纤维素酶蛋白结晶困难，现在关于纤维素酶分子结构与功能关系的研究进展仍比较缓慢。
1.2.2国内研究概况我国纤维素酶的研究开始于20世纪60年代初。
几十年来，北京、上海、成都、无锡、广东、山东、浙江等地的大专院校科研院所进行了纤维素酶的研究工作，选育出一批纤维素酶菌种。
如1968年北京选育出一批纤维素酶菌种;1970年后中国科学院上海植物生理研究所等单位利用诱变方法获得了产酶能力较高的变异株，并进行了生产试验。
70年代后，继续进行纤维素酶产生菌的诱变与选育工作，并对各种微生物来源的纤维素酶组分进行分离纯化、结构和酶学性质的研究;关于纤维素酶的特性、作用机理、培养条件、应用试验等方面的报道文献也较多，如王景林等在吸收国内外经验的基础土，先后引进绿色木霉Sn-91014、康氏木霉NT-15,E曲霉XX-15A，在此基础上采用了紫外线特定电磁波辐射，线性加速器，亚硝基皿等物理化学的诱变方法获得了高产菌株NT15-H，NT15H-XT-15H,XT-15H10。
其中木霉NT-15H 固体培养活力经轻工业部食品质量监督检测中心南京站检侧表明己达到国际先进水平;王成华等采用里氏木霉A3，进行紫外线和业硝基呱复合诱变后，得到了产纤维素酶活力较高的里氏木霉91一菌株;张中良采用均匀设计研究了影响绿色木霉生产纤维素酶的主要因素，他采用了浅盘固体发酵，得出了绿色木霉生产纤维素酶的最佳条件;张荃花等以康氏木霉为菌种进行固体发酵，首先对菌种进行了诱变，并利用酵母菌与康氏木霉间的徽生态关系进行混合发酵，防止了“白毛菌”的污染，提高了酶活力;陈春洪等以稻草、花生壳为主要碳源，研究了里氏木霉GAB的产酶条件。
尹清强等在黑白花奶牛日粮中添加纤维素酶50g/头‘天，产奶量提高8.9%，饲料效率提高10.0%;裴相元等在鹅日粮中加入0.75%纤维素酶后，结果提高了8.92%的日增重和15.34%的饲料效率及降低了5.1 -7.8%的饲料消耗。
从80年代后期开始有不少的国内学者对纤维素酶进行基因结构与遗传重组方面的研究。
如汪天虹等人用鸟枪法从野油菜黄单胞菌S152中克隆到的内切纤维素酶基因，在大肠杆菌中得以表达;从微紫青霉中克隆到的CBHI基因在体外无细胞系统中表达;从瑞氏木霉DNA文库中克隆到的内切葡纤维素酶III基因在酿酒酵母中表达:肖志壮等从里氏木霉DNA文库中分离得到了内切葡聚搪酶侄。